春节后小明特别苦恼，每当这个时候猪场要做病原检测，总是找不到地方：刚过春节，高校还处于寒假状态，不少研究所还未正式上班。到终于有地方做检测的时候，总是要3-5个工作日后才能有结果。小明就纳闷了：抗体都能够自己用金标试纸条检测了，抗原可不可以呢？是不是一定要用昂贵的PCR仪器进行繁琐的PCR扩增呢？或许，小明的这个问题随着LAMP技术的成熟与普及能够得到解决，在猪场自己做病原检测，1个小时内得到结果不再是梦想。
据悉，LAMP（Loop-Mediated isothermal Amplification）——环介导等温扩增技术，是日本学者Notomi在2000年发明的一种新型的核酸体外扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，可在65℃等温条件下扩增60min，即可完成反应，将目的基因扩增109-1010倍。不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断是否含有目标病原。
“LAMP技术与普通PCR不同，不需要PCR仪器，只需要一个浴锅保持在恒温就行。”广东省农业科学院动物卫生研究所人畜共患室主任向华告诉农财宝典记者，与常见的PCR不同，它在扩增核酸的过程中不需要变温的过程，整个过程都是在恒温的环境下完成，需要同时使用两对引物，而且该方法的扩增效率、灵敏度和特异性都较高，是一种应用前景广泛的核酸扩增技术。
“它之所能高效扩增是因为引物有4个，是环状扩增，速度比普通的单向扩增高几个几何等级。”据华南农业大学兽医学院教授张桂红介绍，LAMP引物的设计比常规PCR要复杂得多。一个反应至少包括4条引物，包括一对内引物（FIP和BIP）和一对外引物（F3和B3）；如果再增加一对环引物，反应便可加速而时间减半，大大提高扩增效率。此外，LAMP需要一种特殊的DNA扩增酶，既要有直链延伸能力，又要有链替代扩增的能力，BstDNA聚合酶可以满足以上要求。
据张桂红介绍，目前已有专门设计LAMP引物的Primer Explorer version3软件，用户只需按要求提交目的片断序列，设置相关参数，系统便能给出多种引物组合供用户选择，引物设计的技术细节及注意事项。
据悉，LAMP技术应用于病原体检测不但能克服其他核酸扩增缺陷，还具有以下无法比拟的优势：1、高效。没有变温过程，酶活性丧失少，60min内可将目的片段数量放大109；2、灵敏度比PCR高10-100倍，而且适当延长反应时间可以增加灵敏度；3、特异。2对引物识别6段序列，只要引物设计合理，可以有效减少对非相关序列的扩增；4、简单。恒温反应，不要求复杂的变温设备，用双链作模板时，延长扩增时间可以获得同样的效果，因此反应步骤中可以不包括预变性；5、阳性结果可以直观显示；6、与PCR比较，LAMP对标本中扩增抑制物相对不敏感，可以省略DNA提取步骤；7、由于不需要复杂的变温及产物检测设备，因此LAMP比传统的PCR成本低，约为前者1/10。
“LAMP技术虽然原理复杂，特别是引物的设计相当专业，但这些都是由专业研究单位和试剂公司来完成的，对应用人员来说却是非常的简便，只要把处理好的待检样本和LAMP试剂一起放入65℃中，大约1小时后就能肉眼辨别结果。”向华告诉农财宝典记者，LAMP是一种更简便、更快速、高特异、高敏感的基因扩增法，且其不需要特殊的试剂和仪器，这正是广大一线养殖户所企盼的方法。“国内也有一家公司推出蓝耳病毒的LAMP技术检测试剂盒。”向华认为，随着对LAMP研究的深入，该技术将进一步优化，完善，开发出相应的诊断试剂盒，有望成为简易的常规检测手段。
“举一个简单的例子，口蹄疫病毒有多个血清型与亚型，虽然有不同的试剂盒以区分不同血清型，但不能细致到毒株，而LAMP技术通过对通用引物的设计，将不同毒株的恒变温度设置为不同，这样就可以一目了然地知道究竟猪场感染的是哪个血清型的哪个流行毒株。”据向华介绍，LAMP在日本的研究非常热门，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，目前国内不少科研院所也在开发研究。
《农财宝典》-新牧网记者 李丹
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